动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的主要病理机制。由于雌激素水平下降，绝经后（Postmenopausal, PM）女性动脉粥样硬化风险增加。然而激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy, HRT）对绝经女性动脉粥样硬化患者的帮助很有争议，推测是衰老降低了雌激素的保护作用。绝经后女性随年龄增长，全身铁含量也缓慢地累积。研究表明，铁过载是动脉粥样硬化的危险因素，但铁过载是否影响了雌激素对动脉粥样硬化患者的保护作用尚不清楚。
南京大学附属鼓楼医院血管外科乔彤团队和南京大学医学院教授李宽钰合作在eLife杂志发表了题为Hormone replacement therapy for postmenopausal atherosclerosis is offset by late age iron deposition的研究论文，揭示衰老相关铁累积可能是绝经后期动脉粥样硬化患者难以从HRT中获益的重要原因。
作者首先将绝经后动脉粥样硬化患者分为绝经早期（EPM, 55-65 years old）组和绝经晚期（LPM，＞65 years old）组。与EPM组相比，免疫组化和普鲁士蓝染色显示LPM组患者颈动脉斑块中铁蛋白表达水平升高、组织铁含量增加；血清铁含量和血清铁蛋白水平升高；而雌激素受体α（ERα）在LPM患者斑块中表达下降。以上结果说明，绝经后患者年龄依赖性铁累积，且与ERα水平呈负相关。
为了探究HRT是否对绝经后女性具有动脉粥样硬化保护作用，作者对8周龄的ApoE-/-雌性小鼠进行了卵巢切除术（OVX），一周后开始高脂饮食并分组造模并给予雌二醇E2治疗。主动脉大体油红显示E2治疗在EPM组中可显著延缓动脉粥样硬化的进展，但在LPM组促进了斑块的形成。Western Blotting（WB）显示LPM小鼠主动脉中ERα及其下游ABCA1、VEGF和eNOS的蛋白表达水平明显下降，并在E2处理后进一步降低；而铁代谢指标转铁蛋白受体（TfR1），膜铁转运蛋白（Fpn1）和铁蛋白（Ft-L）的表达表明存在铁累积。而EPM小鼠基因表达水平变化较温和。此外，LPM小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯水平也显著高于EPM小鼠；E2治疗后EPM小鼠血脂水平下降而LPM小鼠血脂水平上升。体外实验用巨噬细胞结果表现一致。以上结果说明LPM小鼠主动脉存在铁累积，ERα表达下降，动脉粥样硬化加重，与巨噬细胞的功能密切相关。
为探究衰老或铁累积导致ERα表达下降是独立因素还是联合因素，作者通过杂交髓系特异性Fpn1敲除小鼠（Fpn1Lyz2/Lyz2）与ApoE-/-小鼠获得了双敲小鼠ApoE-/- Fpn1Lyz2/Lyz2，该小鼠巨噬细胞存在铁累积。在16周龄或40周龄小鼠进行OVX，小鼠手术一周后开始为期8周的E2治疗或注射生理盐水，所有小鼠全程喂养普通饲料。主动脉大体油红显示与ApoE-/- Fpn1Lyz2/Lyz2小鼠生理盐水组相比，注射E2加重了25周龄和49周龄的动脉粥样硬化病变进展；与49周时ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/- Fpn1Lyz2/Lyz2小鼠病变面积也显著增加，说明巨噬细胞铁过载可以促进斑块形成，并发现E2以铁依赖的方式下调ERα的表达。细胞水平也证明了以上结论。
接下来作者进一步探究了铁和E2下调ERα的潜在机制。作者排除了氧化应激导致的ERα启动子区域甲基化从而抑制其转录水平，推测铁和E2可能通过转录后调控的方式下调ERα表达。作者设计一系列的实验排除了E3泛素连接酶BRCA1和AHR的作用，发现Mdm2与ERα的泛素化降解密切相关。此外，在雌性小鼠主动脉和动脉粥样硬化患者斑块中均发现Mdm2在LPM组表达上调。以上结果说明铁累积和E2治疗通过Mdm2介导ERα的蛋白酶体降解。
最后作者通过干预机体内铁的水平，检验是否会减轻铁累积对动脉粥样硬化的影响。作者使用OVX的ApoE-/-小鼠高脂饲料诱导动脉粥样硬化，并通过腹腔注射生理盐水、E2、铁螯合剂DFP（80mg/kg）以及E2+DFP。结果显示DFP治疗可显著延缓病变的进展，降低血清胆固醇和甘油三酯水平，下调主动脉中Mdm2的表达，并上调ERα、ABCA1和VEGF的表达。以上结果说明铁螯合剂治疗可恢复ERα表达水平并减轻E2引发的动脉粥样硬化病变进展。
总结：绝经后女性随年龄增长，动脉粥样斑块内铁缓慢累积。铁累积上调E3连接酶MDM2，促进了HRT治疗下ERα的泛素化降解，导致血管内皮损伤和巨噬细胞脂质累积，加重了动脉粥样硬化病理表现；铁螯合剂可逆转铁累积，发挥动脉粥样硬化保护作用。
创新点：作者阐明了绝经晚期动脉粥样硬化患者HRT保护作用消失的潜在机制，即铁累积增强了HRT作用下ERα的降解，并显示了减少铁的累积可作为潜在治疗协同方案。
本研究发表日eLife附上了哈佛医学院麻省总医院心脏病专家Rajeev Malhotra的评述（Insight），高度评价了本研究成果：This study provides strong evidence that iron accumulation shifts estradiol from a drug that reduces atherosclerosis to a drug that promotes its progression. eLife编辑也给出了评价(Editor’s evaluation): This work will be of broad interest to researchers and clinicians.
本课题得到了南华大学王福俤教授，以色列理工大学Esther Meyron教授，墨西哥Cinvestav的Fanis Missirlis教授和美国NIH的张德良博士的帮助，得到国家自然科学基金（#32271221, 81870348）的资助。
原文链接https://doi.org/10.7554/eLife.80494
Insight链接：https://doi.org/10.7554/eLife.90743